Carica Batterica Totale

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Testo

Carica Batterica Totale
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In questa esperienza abbiamo calcolato la carica batterica totale(CBT) di un campione incognito di acqua. Per carica batterica totale si intende il numero di batteri per millilitro di campione.
Come prima cosa, per poter determinare la quantità di batteri in questo campione, dobbiamo porre le condizioni per cui questi batteri possano crescere e svilupparsi, cioè utilizzare un terreno culturale.
Il terreno che abbiamo utilizzato per questa esperienza è un terreno solido contenente agar, aggiunto ad un terreno liquido nella proporzione di 14 gr\litro.
L’agar è una sostanza gelatinosa estratta da un certo tipo di alga marina; è costituita da polisaccaridi e funziona solo come mezzo di solidificazione del brodo perché il suo apporto nutritivo è nullo.
Il terreno così ottenuto, il PCA(plate count agar), fonde a 80°C e si solidifica a 42-43°C.
Le fasi per preparare il terreno sono le seguenti:
1. Pesata degli ingredienti: prima di pesarli occorre leggere la composizione del terreno ed attenersi ai prodotti da usare.
Per trovare la quantità di terreno che dovevamo pesare, abbiamo usato questa proporzione:
1000 ml : grammi sulla confezione = ml da preparare : X grammi da pesare
Siccome la quantità di grammi per litro, da leggere sulla confezione, era di 20,5 g\l e dovevamo preparare 180 ml di terreno abbiamo pesato 3,7 grammi.
2. Dissoluzione degli ingredienti: si disciolgono sempre gli ingredienti in acqua perché è uno degli elementi essenziali per la vita dei batteri.
In questa operazione ci può essere bisogno di usare calore per favorire lo scioglimento degli ingredienti, stando attenti però ad evitare l’ebollizione che potrebbe alterare le caratteristiche di alcuni componenti del terreno.
Dopo aver pesato il terreno abbiamo preso una beuta da 350 ml, aggiungendo 180 ml di acqua distillata e mescolando sulla fiamma del becco bunsen abbiamo facilitato la solubilizzazione del terreno, fino a renderlo limpido.
3. Aggiustamento del ph: è un’ operazione molto importante perché molti batteri non possono moltiplicarsi in condizioni di alcalinità(basicità) o acidità esagerata.
Si esegue la misurazione a una temperatura inferiore ai 50°C perché questo valore varia a seconda della temperatura.
Se il valore non dovesse essere compreso tra 6,8 e 7,2 per portare il terreno alla neutralità dobbiamo aggiungere una soluzione al 5% di acido cloridrico, se il ph è superiore a 7,2; al contrario se il ph risulta minore di 6,8 dobbiamo aggiungere una soluzione diluita di carbonato di sodio.
4. Distribuzione in recipienti di vetro: i terreni di coltura sono distribuiti in provette con tappo a vite.
5. Sterilizzazione dei terreni: viene eseguita in autoclave a 121°C per 15 minuti.
6. Controllo della sterilità dei terreni:per assicurarsi che il terreno sia sterilizzato viene eseguita un incubazione di almeno 48 ore a 37°C.
7. Conservazione dei terreni: per evitare che il terreno si essicchi viene conservato a 4°C in frigorifero. Se il terreno perdesse acqua si perderebbero le condizioni di stabilità per la vita dei batteri perché diminuirebbe al quantità di acqua libera rendendo impossibile la vita dei batteri.
Mentre preparavamo queste provette abbiamo allestito anche le diluizioni : 1:2, 1:10, 1:100e 1:1000.
Nella diluizione 1:2 abbiamo inserito 5 ml di campione puro e 5 ml di acqua distillata, quindi alla fine avevamo su 1 ml di soluzione 0,5 ml di campione.
Nella diluizione 1:10 abbiamo inserito 9 ml di acqua distillata e 1 ml di campione puro,quindi su 1 ml di diluizione c’è 0,1 ml di campione.
Invece, nella diluizione 1:100 costituita da 9 ml di acqua distillata e 1 ml della diluizione 1:10 , infine quindi avevamo in 1 ml di questa diluizione 0,01 ml di campione puro.
Infine nella diluizione 1:1000 abbiamo inserito 9 ml di acqua distillata e 1 ml della diluizione 1:100, cioè 0,001 ml di campione per millilitro.
Alla fine sono stati conservati in frigorifero a 4°C sia i terreni, per farne evitare la perdita di acqua, che le diluizioni.
La fase successiva è stata quella della semina nelle piastre Petri, cioè quell’ operazione in cui si inocula direttamente il campione contenente i batteri nel terreno.
Abbiamo numerato, prima di seminare, le 10 piastre dividendole in 2 gruppi: 5 piastre che poi verranno incubate a 37°C (batteri fecali) e 5 piastre che verranno incubate a 22°C(batteri tellurici).
Nelle piastre, sia quelle a 37°C che quelle a 22°C, abbiamo inoculato:
1. 1 ml campione puro
2. 1 ml della diluizione 1:2
3. 1 ml della diluizione 1:10
4. 1 ml della diluizione 1:100
5. 1 ml della diluizione 1:1000
1 2 3 4 5

1 ml campione puro 1ml diluizione 1:2 1ml diluizione 1:10 1 ml diluizione 1:100 1ml diluizione 1:1000

Ogni volta che inserivamo una quantità di campione dovevamo aprire il meno possibile la piastra e cambiare la pipetta per aumentare al massimo la sterilità.
Dopo ogni semina, per omogeneizzare il campione nel terreno, abbiamo girato la piastra in senso rotatorio, affinché le colonie batteriche che eventualmente si formeranno, risultino ben distribuite .
Dopo aver seminato in tutte le piastre ,dovevamo disporle attorno al becco bunsen per farle stare ad una temperatura adatta allo sviluppo delle colonie.
Le piastre sono state incubate in termostato, sia quelle a 22°C per 72 ore(batteri tellurici), sia quelle a 37°C per 48 ore(batteri fecali).
Al termine dell’incubazione abbiamo proceduto alla lettura dei risultati, attenendoci ad un ordine preciso di azioni da compiere:
1. Esame delle colonie: cioè osservare il modo in cui si sono formate , perché quelle formatesi dai batteri appartenenti al campione(da considerare) risultano incluse nel terreno e di forma generalmente ellittica.
2. Esame dello sviluppo nelle diverse diluizioni: molto importante perchè se l’esperienza è stata eseguita al meglio, il numero delle colonie dovrebbe diminuire con l’aumentare della diluizione.
3. Conta delle colonie e calcolo della C.B.T.: cioè stabilire quali piastre Petri siano idonee al conteggio; da eliminare le piastre in cui c’è uno sviluppo non omogeneo delle colonie e le piastre in cui c’è uno sviluppo troppo elevato di batteri inquinanti. Quindi possiamo concludere che le piastre idonee alla conta sono quelle in cui il numero delle colonie è compreso tra 30 e 300.
Per quanto riguarda il metodo per effettuare la conta, dobbiamo contare tutte le colonie presenti sulla piastra, ma se il loro numero fosse elevato, si deve ricorrere alla suddivisione in 4 parti dalla piastra, dopo si conta il numero di colonie presenti in uno dei quarti e quello che risulta moltiplicarlo per quattro.
Una volta ottenuti i risultati delle singole piastre, dobbiamo moltiplicarli per i rispettivi fattori di diluizione, ottenendo così i valori riferiti al millilitro.
Dopodichè si procede al calcolo del valore medio, che rappresenta la Carica Batterica Totale.
A conclusione dobbiamo ricordare che la legge stabilisce che i valori massimi ammissibili della C.B.T. affinché un’ acqua possa essere giudicata potabile sono:
- C.B.T. a 22°C : 100 colonie \ ml
- C.B.T. a 37°C : 10 colonie \ ml rapporto batteri fecali tra batteri tellurici 1:10
Il nostro campione è risultato acqua potabile perchè non era stato contaminato, quindi non si sono formati i batter, ma soltanto delle muffe superficiali che erano dovute alla contaminazione esterna.

Esempio



  



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