La carica batterica totale

Materie:Tesina
Categoria:Biologia

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Testo

ALUNNO: Carli Laura CLASSE: 4 C Liceo
RELAZIONE LABORATORIO DI BIOLOGIA
LA CARICA BATTERICA TOTALE
Con questa esperienza analizziamo un campione d’acqua per determinare la sua C.B.T. e stabilire quindi se si tratta di acqua potabile o no.
Per C.B.T. o carica batterica totale di un campione si intende il numero di batteri contenuti in un ml di esso (n° di batteri/ml).
Iniziamo con il preparare un terreno di coltura costituito da sostanze capaci di mantenere la vitalità e di permettere la riproduzione dei batteri fuori dal loro ambiente naturale di vita. I terreni colturali si dividono in terreni liquidi e terreni solidi che a loro volta possono essere terreni ricchi, terreni di arricchimento e selettivi, terreni di identificazione e terreni coagulati.
Per la nostra analisi utilizziamo un terreno solido contenente agar che si ottiene aggiungendo l’agar al terreno liquido. L’agar è una sostanza gelatinosa costituita da polisaccaridi che si estrae da alcuni tipi di alghe marine e che ha solo una funzione solidificante del brodo, in quanto il suo apporto nutritivo è nullo.
Le temperature caratteristiche dell’agar sono quella di fusione a circa 80° e quella di solidificazione che è intorno ai 42/43°.
Per preparare questo terreno seguiamo delle fasi ben precise. Prima fase è quella della pesata degli ingredienti che occorrono per preparare il terreno; per calcolare la giusta quantità di grammi da prelevare utilizziamo una proporzione, leggendo anche le indicazioni sulla bottiglia contenente il terreno: 1000ml : gr sulla confezione = ml da preparare : x gr da pesare. Siccome dobbiamo preparare 180ml di terreno e i gr/l sulla confezione sono 20,5 noi dobbiamo pesare 3,7 grammi di terreno. Dopo facciamo la dissoluzione degli ingredienti che avviene in un contenitore di vetro e sempre con acqua distillata. La facciamo inoltre su un becco bunsen perché il calore favorisce lo scioglimento completo di alcuni composti del terreno; occorre però limitare il riscaldamento, per evitare che un’ebollizione prolungata modifichi le caratteristiche del terreno. La fase successiva è quella dell’aggiustamento del ph. Questa è una fase molto importante perché alcuni batteri non si riproducono in condizioni eccessivamente acide o basiche. Effettuiamo il controllo con una cartina universale che poi paragoniamo con una scala colorata corrispondente ai diversi valori del ph: se questo è maggiore di 7 la soluzione è basica e dobbiamo aggiungere acido cloridrico al 5%, se invece è inferiore a 7 aggiungiamo idrato di sodio in quanto la soluzione è acida. Siccome il valore del ph del nostro terreno è 7, passiamo alla distribuzione in recipienti di vetro. Durante questa fase distribuiamo, appunto, 15 ml di terreno in 10 diverse provette utilizzando una pipetta sterile e poi passiamo alla sterilizzazione del terreno e al controllo della sua sterilità che vengano però eseguite dal professore. Per la sterilizzazione le provette vengono messe nell’autoclave a 120° per 20/30 minuti dopo di che, per assicurarci che il terreno sia sterile vengono incubate nel termostato a 37° per circa 48 ore. Finito il periodo di incubazione occorre passare alla conservazione del terreno; anche questa è una fase importante in quanto il terreno deve essere conservato in frigo alla temperatura di 4°C altrimenti l’evaporazione dell’acqua potrebbe causare la diminuzione della quantità d’acqua indispensabile alla vita dei batteri. Mentre il terreno viene conservato in frigo, prepariamo anche i campioni che poi semineremo nel terreno. Dobbiamo infatti fare diverse diluizioni del campione per evitare che ci sia un eccessivo sviluppo delle colonie dei batteri che poi non riusciamo a contare. Facciamo quindi 4 diluizioni diverse in modo che la quantità di campione presente nel terreno sia sempre meno. La diluizione avviene mescolando il campione con acqua distillata secondo delle proporzioni. Prendiamo allora 8 provette e le dividiamo in due gruppi di 4: la diluizione sarà la stessa per i due gruppi ma cambierà poi l’incubazione, una volta avvenuta la semina. Le numeriamo da 1 a 4; nelle provette 1 mettiamo metà quantità d’acqua distillata(5ml) e metà di campione(5 ml): in queste provette la diluizione sarà di 1:2. Nelle provette 2 inseriamo 1ml di campione e 9 ml di acqua distillata: in questo caso avremo una diluizione di 1:10 che significa che in 1 ml di soluzione avremo 0,1 ml di campione. Nelle provette 3 mettiamo 1ml di soluzione 1:10 e 9ml di acqua distillata: qui la diluizione sarà di 1:100 poiché, sul volume totale di 10ml, avremo solo 0,1ml di campione derivanti dalla diluizione precedente. Facciamo in questo modo anche per le provette 4 dove inseriamo 9ml di acqua e 1ml di soluzione 1:100, dove abbiamo solo 0,01ml di campione, ottenendo una diluizione 1:1000. Ricordiamoci che tutti questi trasferimenti devono essere fatti con pipette sterili. Ora prendiamo 10 piastre Petri e le dividiamo in due gruppi da 5; prendiamo i terreni dal frigorifero e le provette con il campione diluito. A questo punto possiamo iniziare la semina per inclusione: si parla di semina quando inoculiamo direttamente il campione contenente i batteri nel terreno e, parliamo di semina per inclusione quando, con la semina, il campione liquido viene incluso, mescolandolo uniformemente, in un terreno semisolido, o agar. Usando pipette sterili diverse per ogni “diluizione” mettiamo in tutte le piastre 1ml di campione: nella prima inseriremo 1ml di campione puro. nella seconda 1ml di soluzione 1:2, nella terza 1ml di soluzione 1:10, nella quarta di soluzione 1:100 e nell’ultima di soluzione 1:1000. Nell’eseguire questa operazione dobbiamo essere rapidi nell’aprire la piastra e inoculare il campione per non rischiare contaminazioni esterne. A questo punto inseriamo nelle piastre anche i 15ml di terreno e mescoliamo uniformemente con piccoli movimenti rotatori della piastra. Una volta che il terreno si sarà solidificato dividiamo le piastre in due gruppi e le incubiamo, ma con temperatura e tempi diversi. Le prime le incubiamo a 22°C per 72 ore mentre le altre le incubiamo a 37°C per 48 ore. In questo modo possiamo calcolare la carica batterica totale nelle piastre dovuta a batteri diversi: a 22°, infatti, si svilupperanno batteri di origine tellurica presenti normalmente nel terreno, mentre a 37°quelli di origine animale e quindi batteri fecali. Alla fine dell’incubazione passiamo alla lettura dei risultati. Partiamo con il controllare che tutto sia stato svolto correttamente e quindi per prima cosa osserviamo il modo in cui le colonie di batteri si sono sviluppate: quelle incluse nel terreno, piccole e di forma ellittica saranno colonie di batteri presenti nel campione e perciò da considerare, quelle grandi, colorate e sviluppate sulla superficie, saranno dovute invece, a batteri non presenti nel campione ma arrivati nella piastra con contaminazioni esterne, e non sono da considerare. Inoltre se il lavoro è stato eseguito bene il numero delle colonie deve diminuire all’aumentare della diluizione. Una volta controllato tutto questo iniziamo la conta delle colonie e il calcolo della C.B.T.. Scegliamo le piastre idonee al conteggio che generalmente sono quelle con un numero di colonie compreso tra 30 e 300 e quelle in cui lo sviluppo è avvenuto in modo omogeneo. Partiamo dalla prima piastra e iniziamo a contare: se questa fosse troppo popolata possiamo dividerla in parti uguali, contare le colonie presenti in una parte e moltiplicare per il numero delle parti, visto che lo sviluppo dovrebbe essere omogeneo. Per quanto riguarda le piastre successive, dopo aver contato moltiplico per il fattore di diluizione, in questo modo posso confrontare subito i risultati perché, moltiplicando, mi riferisco sempre al millilitro di campione puro della prima piastra. Alla fine del conteggio di tutte le piastre facciamo la media aritmetica fra i risultati ottenuti; ovviamente nella media non includiamo le piastre che sono state considerate non idonee al conteggio. Stabilita poi la carica batterica totale del campione per entrambi i tipi di batteri lo confrontiamo con i limiti stabiliti dalla legge: per i batteri tellurici il valore massimo è 100 colonie/ml mentre per quelli fecali è 10 colonie/ml. Notiamo che il rapporto tra i due tipi di batteri è di 1:10. Il nostro campione è acqua potabile poiché la C.B.T. è zero. Nelle piastre infatti non è presente nessuna colonia di batteri ma solo alcune muffe che però provengono da contaminazioni esterne e non sono quindi da considerare. Una delle piastre a °C non si è nemmeno solidificata e quindi non è stata inclusa nella media aritmetica mentre nella prima piastra a °C si è formata una piccola colonia di batteri che però non è ancora accettabile poiché è l’unica.

muffe nella piastra muffe nella prima piastra e unica colonia di batteri sviluppatasi

Esempio



  



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