Prove biochimiche enterobatteri

Materie:Appunti
Categoria:Biologia

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Testo

OSSIDASI
L’ossidasi и un enzima che catalizza l’ossidazione del citocromo ridotto.
Essa viene messa in evidenza utilizzando un composto che nello stato ridotto и incolore, ma che assume una colorazione particolare allo stato ossidato.
Il test viene utilizzato per distinguere gli enterobatteri da pseudomonas
La prova si esegue su colonie batteriche. E’ opportune che le colonie non si presentino troppo colorate, come puт accadere utilizzando taluni terreni selettivi, per evitare la difficoltа di interpretare l’eventuale positivitа.
E’ necessario inoltre evitare il prelievo delle colonie con ansa di Ni-Cr che puт interferire con l’esito della prova.
Reattivo: da preparare al momento dell’uso data la sua rapida ossidazione
reattivo di Kovacs (sol. acquosa 1% di N,N,N,N terta-metil-p-fenilendiammina); il reattivo pronto per l’uso deve essere incolore
Esistono anche reattivi diversi per l’esecuzione della prova reperibili sul mercato anche sotto forma di dischetti, tamponi, striscette..
Materiale:
una striscia di carta da filtro
un bastoncino di legno o ansa di platino
una piastra petri, anche non sterile
Procedimento
mettere la striscia di carta da filtro nella piastra vuota
porre 1 – 2 gocce di reattivo sulla striscia
prelevare una colonia o una porzione di colonia con il bastoncino di legno
stemperare, in una zona ristretta, la colonia prelevata. Attendere 30 – 60 secondi
Lettura:
positivitа della prova: la comparsa di una colorazione viola intenso entro 30’’ – 60’’
negativitа della prova la mancata comparsa della colorazione entro 30’’ – 60’’
Colorazioni che compaiono dopo 60 secondi non hanno significato di positivitа.
N.B. la prova puт essere eseguita direttamente sulle colonie mettendo su di esse 2-3 gocce di reattivo. La lettura и quella vista sopra, ma deve avvenire entro 10 – 20 minuti.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Prelevare con attenzione il reattivo, si possono usare guanti monouso Tossicitа del reattivo Eseguire il test in un recipiente chiuso Contaminazione Lasciare il bastoncino di legno nella piastra petri dopo l’uso Contaminazione Eliminare il materiale utilizzato per la prova dopo sterilizzazione Contaminazione
STUDIO DEL TIPO DI METABOLISMO BATTERICO
TEST O/F (ossido-fermentazione)
La prova ha lo scopo di evidenziare la modalitа con cui un microrganismo puт demolire (metabolizzare) uno zucchero.
Il test и di solito utilizzato per verificare il tipo di metabolismo nei confronti del glucosio
(altri zuccheri utilizzati sono lattosio e maltosio)
il terreno contiene una bassa quantitа di peptoni per evitare che una loro degradazione, con metabolismo ossidativi, porti alla formazione di prodotti alcalini che maschererebbero l’aciditа derivante dal carboidrato. L’agar –agar presente nel terreno impedisce ai prodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie con conseguente loro diluizione. Ciт renderebbe difficile l’interpretazione del test.
Procedimento:
la prova si esegue a partire da colonie batteriche e non da colture liquide.
Il terreno utilizzato per la prova deve essere sterile.
Terreno: Hugh – Leifson medium (test O/F medium)
Composizione g/l
Digerito pancreatico di caseina 2
Sodio cloruro 5
K2HPO4 0,3
Agar-agar 2,5
Blu di bromotimolo 0,03
pH finale 7,1+0,1
Preparazione del terreno:
il terreno base viene preparato secondo le indicazioni riportate sulla confezione.
Lo zucchero da saggiare puт essere addizionato al terreno:
Durante la preparazione, pesando la quantitа necessaria e sciogliendola nel terreno
In questo caso и necessario utilizzare una temperatura di sterilizzazione di 115-118°C
Per 10 –15 min.
Dopo la sterilizzazione del terreno addizionando una soluzione dello zucchero sterilizzato per filtrazione, la concentrazione finale dello zucchero nel terreno pronto per l’uso deve essere dell1%. Ciт si realizza preparando e sterilizzando una soluzione al 10% del carboidrato e addizionandone 10 ml per ogni 100 ml di base.
STUDIO DEL TIPO DI METABOLISMO BATTERICO TEST O/F (ossido-fermentazione)
Inoculo del terreno:
devono essere inoculate, per ogni test , 2 provette di terreno.
Prelevare con un ago una porzione di colonia o una colonia intera.
Eseguire una infissione per 2/3 del terreno, il terreno и semisolido e tale tipo di semina va quindi fatta con attenzione: sterilizzando tutto l’ago che viene infisso nel terreno,
raffreddandolo bene per non liquefare il terreno durante l’inoculo.
In una dei due terreni inoculati stratificare alcuni ml di olio minerale (olio di vaselina o paraffina) in modo da ottenere uno strato di 2-3 cm sopra la superficie del terreno.
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C o la temperatura ottimale del microrganismo in esame
fino a 7 giorni dopo l’inoculo
Lettura: verificare la presenza di sviluppo e l’eventuale viraggio del terreno al giallo o al blu in entrambi i terreni. La lettura viene eseguita ogni 24 ore per 7 giorni
Interpretazione del risultato:
Terreno senza paraffina
Aerobiosi Terreno con paraffina
Anaerobiosi Tipo di metabolismo nei confronti dello zucchero Giallo Verde Met. Ossidativo
Microrganismo ossidante Ox Giallo Giallo Met. Fermentativo
Microrganismo fermentante F Blu
(verde) Verde
(blu)
Microrganismo alcalinizzante Al Verde Verde Nessuna utilizzazione
Microrganismo inerte I
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura ,dopo la lettura,
previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA’ DI FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI
Per determinare la capacitа fermentativa di un microrganismo si utilizza un terreno nutritivo che contiene: un indicatore di ph, lo zucchero o il polialcool da saggiare e una campanella di Durham se и necessario evidenziare anche la produzione di gas.
Terreno utilizzato: brodo per fermentazione al rosso fenolo
Composizione g/l:
peptone di carne g 10
estratto di carne g 3
cloruro di sodio g 5
rosso fenolo g 0,018
zucchero o polialcool g 10
pH finale 7,4 + 0,1

Preparazione:
il terreno base viene preparato secondo le indicazioni riportate sulla confezione.
Lo zucchero o il polialcool da saggiare viene aggiunto al terreno base con una delle seguenti modalitа:
durante la preparazione del terreno base, pesando l’opportuna quantitа del composto
dopo la sterilizzazione del terreno, addizionando una opportuna quantitа di soluzione dello zucchero, sterilizzata per filtrazione ( es: 10 ml soluzione al 10% di zucchero per 100 ml di terreno base)
dopo la sterilizzazione del terreno, addizionando un dischetto di zucchero
N.B. La concentrazione del carboidrato nel terreno pronto per l’uso и dell’1%, salvo
casi particolari.
Se и necessario evidenziare la produzione di gas inserire nel terreno una campanella di Durham prima della sterilizzazione.
DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA’ DI FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI
Tecnica di semina
и possibile utilizzare una delle seguenti tecniche:
un’ansata di agar-coltura, avendo cura in questo caso di emulsionare con cura l’inoculo
una goccia di coltura del microrganismo in esame
N.B. inoculare anche una provetta di solo terreno base come controllo negativo
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo,
per 24- 48 ore o piщ a seconda dei casi
Lettura:
Controllo negativo:
sviluppo del microrganismo senza variazioni di colore del terreno
Prova positiva :
si ha fermentazione del carboidrato o del polialcool quando si osserva il viraggio al giallo dell’indicatore presente nel terreno di coltura
Produzione di gas:
lo svuotamento totale o parziale della campanella di Durham indica la produzione di gas conseguente all fermentazione
Prova negativa:
il carboidrato o il polialcool non sono fermentati se il terreno, pur evidenziando uno sviluppo, non cambia la sua colorazione iniziale (arancione-rossa)
il carboidrato o il polialcool non sono fermentati se il terreno, pur evidenziando uno sviluppo, vira al rosso (confrontare con il controllo negativo)
Una colorazione arancione va interpretata caso per caso.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
STUDIO DELLA MOBILITA’ BATTERICA
La mobilitа dei batteri и un carattere che viene utilizzato nell’identificazione di alcune specie batteriche. Alcuni ceppi batterici possono risultare poco mobili al primo isolamento e sono necessari alcuni accorgimenti tecnici per metterla in evidenza.
Nello studio della mobilitа riveste grande importanza la temperatura di incubazione delle colture, infatti non sempre la temperatura ottimale di incubazione и la temperatura piщ adatta per evidenziare la mobilitа ad es: un microorganismo puт essere mobile a 20°C, ma risultare immobile se incubato a 37°C.
Lo studio della mobilitа di una specie batterica si puт effettuare:
tramite osservazione diretta al microscopio utilizando la tecnica della goccia pendente
tramite l’utilizzo di terreni semisolidi
Studio della mobilita’ in terreno semisolido
Terreno utilizzato:
terreno per test della mobilitа o agar molle
Composizione g/l
Triptone 10
Cloruro di sodio 5
Agar-agar 5
pH finale 7,4 Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
Preparazione del terreno:
sciogliere i componenti del terreno in un adatto volume di acqua distillata, distribuire il terreno, in ragione di 8-10 ml per provetta. Dopo la sterilizzazione far solidificare il terreno in posizione verticale.
Tecnica di semina:
per infissione. Data la consistenza semisolida del terreno prestare attenzione all’infissione che deve formare un unico canale, il piщ possibile verticale, per 2/3 del terreno (non eseguire una infissione che tocchi il fondo della provetta).
Temperatura e tempo di incubazione:
alla temperatura piщ adatta ad evidenziare la mobilitа; di solito si utilizzano i 20°C
per 24-48 ore o piщ se necessario.
STUDIO DELLA MOBILITA’ BATTERICA
Lettura:
Prova positiva: microrganismo mobile
il microrganismo in esame risulta mobile se si и sviluppato oltre il canale di infissione, sia verso il basso che lateralmente.
Prova negativa: microrganismo immobile
Il microrganismo in esame risulta invece immobile se si и sviluppato unicamente lungo il canale di infissione.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
FLUIDIFICAZIONE DELLA GELATINA (produzione di gelatinasi)
La gelatina и una miscela di proteine ottenuta per idrolisi del collagene (costituente fondamentale del tessuto connettivo). Industrialmente viene estratta dalle ossa di animali e dalla vescica natatoria di alcuni pesci (colla di pesce)
La gelatina gelifica al di sotto di 25°C ; a temperature superiori и liquida.
La demolizione della gelatina avviene per l’azione proteolitica dell’enzima gelatinasi che la degrada nei suoi amminoacidi costituenti, causandone la fluidificazione.
Terreno utilizzato:
gelatina nutritiva o brodo nutritivo addizionato del 10-15% di gelatina
Composizione:
gelatina 120 g
peptone 8 g
ph finale 7+ 0,2
Preparazione del terreno:
secondo le indicazioni sulla confezione. Mescolare bene la polvere pesata con l’acqua durante il riscaldamento, che deve avvenire lentamente (se possibile a bagnomaria o a vapore fluente). Distribuire in provetta 10 ml di terreno e solidificare in posizione verticale.
Tecnica di semina:
per infissione (inoculare con ago 2/3 del terreno)
Temperatura e tempo di incubazione:
metodo lento: a 20-22°C fino a 30 giorni dall’inoculo
metodo rapido: a 32-37°C per 48-72 ore
FLUIDIFICAZIONE DELLA GELATINA (produzione di gelatinasi)
Lettura:
metodo lento: osservare periodicamente la coltura per constatare la fluidificazione della gelatina. E’ possibile osservare anche le forme assunte dalla parte fluidificata della gelatina che sono caratteristiche per alcuni tipi di microrganismi e possono essere quindi utilizzate per l’identificazione.
metodo rapido: prima di osservare il terreno и necessario raffreddarlo in un bagno di ghiaccio o in frigorifero (per 30 min). Questo metodo non consente di osservare le forme della parte fluidificata della gelatina, ma solamente la fluidificazione.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
DEGRADAZIONE DEGLI AMMINOACIDI
La prova permette di evidenziare l’utilizzazione di un amminoacido da parte di un microrganismo. L ‘avvenuta utilizzazione puт essere messa in evidenza:
evidenziando la scomparsa dell’amminoacido (procedura piuttosto complessa)
evidenziando la formazione di prodotti del metabolismo dell’amminoacido (es: ammine e anidride carbonica)
I metodi utilizzati in laboratorio sfruttano, al fine di evidenziare l’utilizzazione dell’amminoacido, l’accumulo di ammine e il conseguente innalzamento del pH del terreno che viene messo in evidenza dal viraggio di un indicatore.
I metodi di laboratorio piщ comuni consentono di evidenziare l’utilizzazione solo di tre amminoacidi:
arginina
lisina
ornitina
Per gli altri amminoacidi le procedure risultano molto complesse e difficilmente utilizzabili nella routine. I terreni utilizzati per l’esecuzione della prova possono variare nella composizione a seconda della specie batterica in esame.
Terreno utilizzato:
brodo per decarbossilazione di Moeller
Composizione in g/l
Peptone 5 g
Estratto di carne 5 g
Glucosio 0,5 g
Piridossale 0,005 g
Bromocresolo porpora 0,02 g
pH finale 6,0 + 0,1
Preparazione:
Seguire le istruzioni presenti sulla confezione del terreno. Al terreno base va addizionato l’amminoacido da saggiare in concentrazione pari all’1% (p/v) se si dispone dell’amminoacido in forma L : L-arginina, L-lisina, L-ornitina.
Se si dispone di amminoacidi in forma DL la concentrazione nel terreno deve essere del 2% (p/v). Il terreno viene distribuito in provetta (4-5 ml)
NOTA BENE :
Controllare con cura il pH del terreno prima della distribuzione.
Preparare sempre una provetta di terreno base senza amminoacidi come controllo.
Il terreno pronto per l’uso ha una colorazione porpora.
DEGRADAZIONE DEGLI AMMINOACIDI
Tecnica di semina:
per dispersione con ansa, evitando inoculi pesanti (troppo abbondanti)
Inoculare anche un terreno senza amminoacido come controllo negativo.
Dopo l’inoculo versare sulla superficie del terreno uno strato di olio di vaselina (o paraffina liquida). Tale operazione va eseguita facendo scorrere lentamente lungo le pareti della provetta la paraffina in modo da stratificarla sulla superficie liquida.
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C per 4 giorni.
Lettura:
controllare giornalmente le variazioni di colore del terreno con amminoacido e del terreno di controllo (senza amminoacido).
Periodo di incubazione Terreno con amminoacido Terreno di controllo
(senza amminoacido) Esito della prova Dopo 24 ore
Giallo Giallo Non ancora determinato Dopo 4 giorni Giallo Giallo Negativo
amminoacido non utilizzato Dopo 4 giorni Porpora Giallo Positivo
amminoacido utilizzato
La fermentazione del glucosio e il conseguente abbassamento del pH del terreno favorisce le reazioni di decarbossilazione. Tali reazioni producono ammine che rendono alcalino il terreno con conseguente viraggio dell’indicatore da giallo a porpora.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
UTILIZZAZIONE DEI NITRATI
I microrganismi sono in grado, a seconda del loro corredo enzimatico, di utilizzare
i nitrati e ridurli a composti quali:
nitriti
ammoniaca
ossido di azoto
azoto gassoso
La prova viene eseguita in un terreno che contiene nitrato; i prodotti di riduzione vengono messi in evidenza con l’uso di reattivi specifici o accorgimenti particolari.
Terreno utilizzato:
Brodo nitrati
Composizione g/l
triptone 10 g
cloruro di sodio 5 g
Nitrato di potassio 1 g
pH finale 7,2
Preparazione :
seguire le indicazioni sulla confezione. Il terreno viene distribuito in provetta (5 - 7 ml) nella quale viene posta anche una campanella di Durham.
Sterilizzazione a 121°C per 15 min.
Tecnica di semina:
un’ansata di agar-coltura o di brodocoltura.
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C (o eventuale altra temperatura ottimale) fino a 7 giorni.
UTILIZZAZIONE DEI NITRATI
Lettura:
controllare la crescita del microrganismo osservando la torbiditа della brodocoltura prima di eseguire le prove indicate.
Prova dei nitrati Terreno
di coltura Campanella Durham Reattivo Colorazione Significato Esito
della prova Brodo nitrati Svuotata completamente
o parzialmente Nessuno Nessuna Presenza
di gas
Positivo
Riduzione di nitrati ad azoto Brodo nitrati Non svuotata Nessler 1 ml in
1 ml brodocoltura Giallo-arancio Presenza di ammoniaca Positivo
Riduzione di nitrati ad ammoniaca Brodo nitrati Non svuotata Griess 5-6 gtt. Rossa Presenza di
nitriti Prova positiva
Riduzione di nitrati a nitriti
Prova dei nitrati Terreno
di coltura Campanella Durham Reattivo Colora
zione Reattivo supplementare Colora
zione Esito della prova Brodo nitrati Non svuotata Griess
5-6 gtt Nessuna Polvere di zinco
(una punta di spatola) Rossa
Lo zinco ha ridotto i nitrati presenti Negativo
Mancata riduzione dei nitrati Brodo nitrati Non svuotata Griess
5-6 gtt Nessuna Polvere di zinco
(una punta di spatola) Nessuna Positivo
Riduzione dei nitrati a composti diversi da ammoniaca, nitriti, azoto.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
STUDIO DEL METABOLISMO DEL GLUCOSIO:
PROVA DEL ROSSO METILE E PROVA DI VOGES PROSKAUER
La prova del rosso metile (RM) e la prova di Voges Proskauer (VP) sono importanti per l’identificazione degli enterobatteri..
Gli enterobatteri utilizzano il glucosio attraverso due particolari vie fermentantative,
che partendo dall’acido piruvico originano prodotti finali diversi:
la fermentazione butandiolica (o glicol-butilenica) ha come prodotti finali principali: etanolo, 2,3 butandiolo, acido formico (che in presenza di formico-idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica)
la fermentazone acido mista ha come principali prodotti finali:
etanolo, acido acetico, acido lattico, acido formico (che in presenza di formico-
idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica)
Terreno utilizzato:
brodo MRVP
Composizione g/l
peptone 5 g
D(+) glucosio 5 g
di-potassio idrogeno fosfato 2,5 g
potassio di-idrogeno fosfato 2,5 g
ph finale 7,5
Preparazione:
secondo le istruzioni presenti sulla confezione.
Il terreno viene distribuito in provette (5 ml) e sterilizzato.
Tecnica di semina:
una o due colonie da disperdere omogeneamente nel terreno
un o due gocce di brodocoltura
Temperatura e tempo di incubazione:
32 – 37°C
per 3 – 4 giorni
PROVA DEL ROSSO METILE E PROVA DI VOGES PROSKAUER
Lettura:
controllare la crescita del microrganismo osservando la torbiditа del terreno ed eseguire poi la prova di Voges Proskauer e quella del rosso metile.

Prova di Voges-Proskauer (ricerca dell’acetoina o acetilmetilcarbinolo):
la prova mette in evidenza la produzione di acetilmetilcarbinolo derivante dalla fermentazione glicol-butilenica del glucosio. Il ph del terreno in questo caso si avvicina alla neutralitа. L’acetilmetilcarbinolo o acetoina puт ossidarsi ad opera di una deidrogenasi NAD dipendente, ma puт ossidarsi anche spontaneamente a diacetile. E’ proprio il diacetile che dа la reazione di Voges Proskauer.
Prova di Voges Proskauer (VP)
Terreno utilizzato
Reattivo utilizzato Procedimento Brodo RMVP
Eseguire la prova dopo 2 giorni di incubazione Soluzione KOH 40%
Soluzione 1-naftolo
(o alfa naftolo) Prelevare 1 ml di brodocoltura
Aggiungere 0,2 ml di soluzione KOH 40%
e 0,6 ml di sol. 1-naftolo
Prova di Voges Proskauer (VP)
Tempo di reazione
Prova positiva Prova negativa 10 minuti, agitando di tanto in tanto, lasciare esposto all’aria. Colorazione rossa Nessuna colorazione
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Prelevare la brodocoltura con pipetta monouso, o puntale monouso o pipetta vetro con pipettatore Produzione di aerosols
Contaminazione Eliminare i materiali monouso e la coltura dopo lettura previa sterilizzazione
Pipette vetro decontaminare con ipoclorito Contaminazione
PROVA DEL ROSSO METILE E PROVA DI VOGES PROSKAUER
Prova del rosso metile:
mette in evidenza l’elevata aciditа del terreno di coltura (ph < 4,5) dovuta all’accumulo di prodotti della fermentazione acido-mista del glucosio.
Prova del rosso metile (RM)
Terreno utilizzato
Reattivo utilizzato Procedimento Eseguire la prova dopo almeno 3 giorni di incubazione Soluzione di rosso metile Alla brodocoltura rimasta dopo l’esecuzione della prova VP
aggiungere 4-5 gocce di soluzione di rosso metile
Prova del rosso metile (RM)
Tempo di reazione
Prova positiva Prova negativa Immediata Colorazione rossa Colorazione gialla o arancione
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche

UTILIZZAZIONE DEL CITRATO COME UNICA FONTE DI CARBONIO
La prova evidenzia la capacitа del microrganismo di utilizzare il citrato come unica fonte di carbonio. Il terreno di coltura non contiene peptoni, ma contiene:
CITRATO DI SODIO come fonte di carbonio
AMMONIO FOSFATO come fonte di azoto
Sul terreno pertanto possono svilupparsi solamente i microrganismi in grado di utilizzare tali sostanze.
Terreno utilizzato:
agar citrato di Simmons
Composizione g/l
NaCl 5 g
MgSO4 x 7H2O 0,2g
(NH)4H2PO4 1 g
K2HPO4 1 g
Citrato di sodio 5 g
Blu bromotimolo 0,08 g
Agar-agar 20 g
pH finale 7
sterilizzare a 121°C per 15 minuti
il terreno viene distribuito in provetta e solidificato a becco di clarino.
Inoculo:
con un’ansata di patina batterica sulla parte inclinata del terreno, facendo attenzione a non trasportare tracce del terreno colturale sul quale si и sviluppata la coltura (per non fornire altre fonti di carbonio diverse dal citrato)
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo per 24-48 ore
UTILIZZAZIONE DEL CITRATO COME UNICA FONTE DI CARBONIO
Lettura:
l’avvenuta utilizzazione del citrato si evidenzia con lo sviluppo batterico ed il viraggio dell’indicatore al blu
la mancata utilizzazione del citrato si evidenzia con il mancato sviluppo batterico ed il conseguente mancato viraggio del terreno che rimane verde (colore del terreno prima della semina)
Utilizzazione dei citrati in terreno liquido
L’utilizzazione del citrato puт essere messa in evidenza nel brodo di Koser che nella sua composizione differisce da quello di Simmons per la mancanza dell’indicatore e dell’agente solidificante (agar-agar)
La lettura avviene semplicemente osservando l’eventuale sviluppo del microrganismo che indica l’utilizzazione del citrato.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
UTILIZZAZIONE DELLA FENILALANINA
E PRODUZIONE DI ACIDO FENILPIRUVICO (APP)
L’amminoacido fenilalanina puт essere deaminato ossidativamente ad acido fenilpiruvico mediante l’enzima fenilalanina-deaminasi.
L’acido fenilpiruvico prodotto viene messo in evidenza facilmente con una soluzione di cloruro ferrico.
La prova и particolarmente imporante per l’identificazione del genere Proteus.
Terreno utilizzato:
agar fenilalanina
Composizione g/l
estratto di lievito 3 g
peptone 10 g
NaCl 5 g
K2HPO4 1 g
L– fenilalanina 1 g
Agar-agar 20 g
pH finale 7,2
sterilizzare a 121°C per 15 min.
il terreno viene distribuito in provetta e solidificato a becco di clarino.
Inoculo del terreno:
un’ansata di un’agar-coltura o di brodocoltura del microrganismo in esame
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C per 24-48 ore
UTILIZZAZIONE DELLA FENILALANINA E PRODUZIONE DI ACIDO FENILPIRUVICO (APP)
Lettura:
dopo aver verificato l’avvenuto sviluppo del microrganismo, versare sulla superficie del becco di clarino alcune gocce (5 – 6) di una soluzione di cloruro ferrico al 10%
Prova positiva: la comparsa di una colorazione verde della superficie del terreno indica presenza di acido fenilpiruvico (APP) e quindi l’avvenuta deaminazione della fenilalanina.
Prova negativa: la mancata comparsa di colorazione indica la mancata utilizzazione della fenilalanina.
N.B. la soluzione di cloruro ferrico ha una colorazione gialla.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
PRODUZIONE DI INDOLO (prodotto del metabolismo del triptofano)
I microrganismi che degradano l’amminoacido triptofano producono indolo, un composto volatile che viene messo in evidenza mediante uno specifico reattivo.
La presenza dell’indolo indica l’avvenuta utilizzazione del triptofano.
Terreno utilizzato:
acqua peptonata o acqua triptonata
il peptone presente nel terreno deve contenere una certa quantitа dell’amminoacido triptofano.
Composizione g/l
Triptone 10 g
NaCl 5g
pH finale 7,2
Il terreno viene distribuito in provetta (5 ml)
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
Tecnica di semina:
un’ansata di agarcoltura o di brodocoltura per dispersione nel terreno
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo per 24-48 ore
Lettura:
dopo aver verificato lo sviluppo del microrganismo, addizionare alla brodocoltura
0,5 ml (10 gtt.circa) di reattivo di Kovacs (che viene conservato a +4°C)
ed agitare con cura.
Prova positiva: la comparsa immediata di un anello rosso sulla superficie del terreno indica la presenza di indolo.
Prova negativa: la mancata comparsa dell’anello rosso e l’osservazione di un anello giallo pallido indica invece l’assenza di indolo.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Agitazione della brodocoltura con cautela
Non и necessario l’uso del Vortex Contaminazione per fuoriuscita di liquidi o formazione di aerosols Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
UTILIZZAZIONE DELL’ACIDO DESOSSIRIBONUCLEICO (DNA)
PROVA DELLA Dnasi
L’enzima extracellulare desossiribonucleasi (Dnasi) и in grado di scindere il DNA, in particolare и in grado di idrolizzare i legami 5’-fosfodiesterici della molecola.
Terreni utilizzati:
Dnasi test agar
Composizione g/l
Peptone 20 g
DNA 2 g
NaCl 5 g
pH finale 7,3
Sterilizzare a 121°C per 15 min
Il terreno viene distribuito in piastra (diam: 60mm o da 90 mm)
Dnasi test agar con verde metile (Dnase test agar with methyl green)
Composizione g/l
Triptosio 20 g
DNA 2 g
NaCl 5 g
Verde metile 0,05 g
pH finale 7,3
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
Il terreno viene distribuito in piastra (diam: 60mm o da 90 mm)
Tecnica di semina:
inoculare pesantemente con ansa, concentrando l’inoculo al centro della piastra
Temperatura e tempo di incubazione:
37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo per 24 – 48 ore
PROVA DELLA Dnasi
Lettura:
Dnase test agar
Versare sulla superficie della piastra 1-2 ml di HCl 1N ed attendere qualche minuto.
Osservare la piastra contro fondo scuro.
Prova positiva: la comparsa di un alone trasparente intorno alla patina batterica, mentre il terreno circostante risulta opaco. Ciт и dovuto alla scomparsa dell’acido desossiribonucleico (alone trasparente) ed alla precipitazione dell’acido desossiribonucleico non idrolizzato (terreno circostante opaco)
Prova negativa: la mancata presenza dell’alone trasparente. Tutto il terreno risulta pertanto opaco.
Dnase test agar con verde metile: la lettura del risultato viene fatta direttamente osservando il terreno di coltura.
Prova positiva: la comparsa di un alone trasparente intorno alla patina batterica, mentre il terreno circostante risulta verde. Ciт и dovuto alla scomparsa dell’acido desossiribonucleico polimerizzato (alone trasparente il verde metile non piщ legato al DNA schiarisce) ed alla presenza dell’acido desossiribonucleico polimerizzato e quindi ancora legato al verde metile (terreno circostante verde)
Prova negativa: la mancata presenza dell’alone trasparente. Tutto il terreno risulta pertanto verde.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione con colture batteriche
RICERCA DELLA TERMONUCLEASI
(Dnasi termoresistente)
L’enzima termonucleasi o DN-asi termoresistente viene prodotta e liberata dalla maggior parte dei ceppi di Staphylococcus aureus.
L’enzima idrolizza l’acido desossiribonucleico ed и caratterizzato da una elevata termoresistenza, cioи и in grado di esplicare la sua azione anche dopo essere stato sottoposto ad un riscaldamento a 100°C per 15 minuti. Altri esoenzimi con azione simile alla termonucleasi vengono inattivati dal trattamento citato.
La prova viene eseguita su un terreno nel quale il colorante blu di o-toluidina si lega all’agar-agar ed al DNA formando aggregati molecolari ed assumendo una colorazione blu scuro.
Quando il blu di toluidina invece si trova legato solamente all’agar-agar assume una colorazione rosa.
Materiale e reattivi:
terreno pronto per l’uso che si presenta di colore blu scuro
dischetti di carta diam. 6 mm sterili (dischi bianchi)
dischetti impregnati di termonucleasi diam. 6 mm sterili (dischi controllo positivo)
una pinzetta
una brodocoltura fresca, di 6 – 18 ore piuttosto torbida, in BHI del microrganismo
Procedimento:
trattare la brodocoltura del ceppo in esame a 100°C per 15 minuti in bagnomaria
preparare sul banco di lavoro la piastra di terreno, i dischi bianchi, i dischi di controllo positivo
con la pinzetta, precedentemente posta in un becker con alcool, prelevare un dischetto bianco ed immergerlo alcuni secondi nella brodocoltura trattata
eliminare l’eccesso di liquido, premendo contro le pareti della provetta,
porre il dischetto sulla superficie del terreno, premere delicatamente per farlo aderire
prelevare un dischetto di controllo positivo e porlo sulla superficie del terreno
come controllo negativo и possibile immergere un dischetto bianco nel brodo di coltura sterile e porlo anch’esso sulla superficie della piastra
N.B. i dischetti vanno distanziati tra loro e dal bordo della piastra di circa 20 – 25 mm
Siglare sul fondo della piastra i vari dischetti con lettere o numeri ad es: C+ o P per controllo positivo C- o N per controllo negativo e con 1, 2, 3 i campioni.
(Dnasi termoresistente)
Temperatura e tempo di incubazione:
50°C per 3 – 5 ore
oppure
37°C per 6 – 12 ore ed eventualmente fino a 24 ore
Lettura:
Presenza di termonucleasi: viene svelata dalla comparsa di un alone rosa intorno al dischetto.
Assenza di termonucleasi: mancata comparsa dell’alone rosa. Il terreno rimane blu scuro intorno al dischetto.
Il controllo positivo deve presentare l’alone rosa.
Il controllo negativo non deve presentare alcun alone.
Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione Rischio possibile Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Contaminazione

RICERCA DELLA COAGULASI (sec. Kit Merck)
La coagulasi и un esoenzima, di natura proteica, che agisce sul fibrinogeno presente nel plasma trasformandolo in fibrina.
Tale reazione ha luogo dopo che la coagulasi si и legata con un fattore (CRF) presente nel plasma di alcuni animali (ad esempio il coniglio).
La prova viene eseguita per confermare l’ identificazione di colonie sospette di Staphylococcus aureus sviluppatesi su terreni selettivi.
La prova si esegue con plasma di coniglio ed una brodocoltura del ceppo in esame.
Schematizzando:
Plasma + brodocoltura S. aureus ( PLASMA COAGULATO (prova positiva)
Materiale e reattivi necessari:
provette da sierologia 8x80 o simili, se possibile sterili
parafilm per tappare le provette
pipette automatiche da 100 e 300 microlitri, se possibile utilizzare puntali sterili
plasma di coniglio (ossalato o con EDTA) liofilizzato che viene reidratato alcuni minuti prima dell’esecuzione della prova, secondo le istruzioni presenti sulla confezione.
Brodocoltura fresca del microrganismo in esame, di solito si utilizza una brodocoltura in Brain Heart Infusion di 18 – 24 ore di incubazione.
Procedimento:
prelevare 0,3 ml ( = 300 microlitri) di plasma di coniglio e porli nella provetta da sierologia
tappare bene con parafilm
agitare bene, anche per inversione in modo da omogeneizzare bene plasma e brodocoltura
incubare a 37°C per 1 – 4 ore .
se dopo 4 – 6 ore l’esito della prova и negativo, prolungare l’incubazione e ripetere il controllo dopo 24 ore.

RICERCA DELLA COAGULASI
Lettura:
per il controllo della coagulazione inclinare ogni ora la provetta da un lato con cautela (NON AGITARE)
Positivitа della prova: il test viene considerato positivo quando il contenuto della provetta per due terzi coagulato
Negativitа della prova: se non si ha la formazione di alcun coagulo (il plasma rimane fluido) o se si ha la formazione di un coagulo troppo piccolo.

CONTROLLO DI QUALITA’
Per confrontare le risposte del test eseguito su campione incognito, o per controllare la validitа del kit in uso, и possibile eseguire test che diano risposte sicuramente positive o negative. Allo scopo и necessario utilizzare:
come controllo positivo una coltura di S. aureus coagulasi positivo (ATCC 25923)
come controllo negativo il terreno liquido sterile nel quale si и sviluppata la coltura
( Brain Heart Infusion);
una coltura di S. epidermidis coagulasi negativo (ATCC 12228)
TEST SU VETRINO
Il test della coagulasi puт essere eseguito su vetrino utilizzando una goccia di plasma di coniglio e una colonia sospetta.
La formazione di piccoli coaguli visibili ad occhio nudo indica la positivitа della prova. Tale test mette in evidenza il cosiddetto clumping factor ( detta anche coagulasi legata) e non la coagulasi libera del test in provetta. Esso pertanto puт servire come screening orientativo e deve essere confermato dal test in provetta.
N.B. Il test su vetrino puт dare false risposte positive e fenomeni di autoagglutinazione.
RICERCA DELIA BETA-GALATTOSIDASI (TEST ONPG)
La fermentazione del lattosio и uno dei test classici per l'identificazione di molti
microrganismi. La metodica abituale si basa sulla dimostrazione della produzione
di acido dopo che il disaccaride и stato scisso in glucosio e galattosio dall'enzima
beta-galattosidasi. E' tuttavia necessario che il lattosio possa penetrare all'interno della
cellula grazie all'azione di una specifica permeasi, affinchи la scissione possa avvenire.
Il ruolo della permeasi e della beta-galattosidasi и fondamentale per la classificazione dei microrganismi in:
categoria Fermentazione del lattosio entro Possiedono l’enzima permeasi Possiedono l’enzima beta-galattosidasi Lattosio fermentanti energici
18 – 24 ore Si Si Lattosio fermentanti lenti
Oltre le 24 ore No Si Non fermentanti il lattosio
No No No
Il test ONPG permette di mettere in evidenza la presenza dell'enzima beta-galattosidasi
indipendentemente dalla presenza dell'enzima permeasi. In altre parole и possibile
distinguere i lattosio fermentanti lenti (che possiedono la beta-galattosidasi) dai non
fermentanti il lattosio (che non possiedono la beta-galattosidasi).
Il reattivo utilizzato и il galattoside sintetico Orto-NitroPhenil-І-D
Galattopiranoside, (ONPG) che non necessita di permeasi per penetrare nella cellula
e che viene idrolizzato dai microrganismi come il lattosio.
Poichй il gruppo orto-nitrofenolo и cromogenico, quando l'ONPG viene scisso in
soluzione alcalina si forma una soluzione gialla.
Schematizzando:
idrolisi
microrganismo + ONPG (incolore)
o-nitrofenolo (giallo)
І-galattosidasi
Il test consente di differenziare i lenti fermentanti dai non fermentanti ad es: Citrobacter(onpg +) da Shigella (onpg -) .
RICERCA DELIA BETA-GALATTOSIDASI (TEST ONPG)
Procedimento
1. In una provetta trasferire 0,2 0,3 ml di soluzione fisiologica
2. Porre nella soluzione un disco di ONPG, prelevato, in asepsi, con pinzette
perfettamente asciutte e pulite
3. Prelevare la colonia in esame ed emulsionarla con cura nella soluzione fisiologica
contenente il disco ONPG
Incubare a 37°C per 6 ore, esaminando la sospensione ogni ora.
Prova positiva: la comparsa di una colorazione gialla dopo 1-6 ore di incubazione indica
la presenza dell'enzima І-galattosidasi. la colonia del microrganismo in esame appartiene
quindi ad un lattosio fermentante
Prova negativa: la sospensione rimane incolore dopo 6 ore. E' opportuno incubare tale
sospensione fino a 24 ore per rilevare i latto- *tV W і
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