Preparazione di un terreno di coltura

Materie:	Appunti
Categoria:	Microbiologia
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Data:	19.03.2008
Numero di pagine:	6
Formato di file:	.doc (Microsoft Word)

TITOLO: PREPARAZIONE TERRENI DI COLTURA

SCOPO: Preparare un terreno di coltura

MATERIALI E ATTREZZATURE UTILIZZATE:
• Bilancia;
• Beuta;
• Bacchetta;
• Carta d’alluminio;
• Spatola;
• Cilindro graduato;
• Piastra riscaldante;
• Vetrino d’orologio;
• Indicatori di pH (cartina al tornasole);
• Spruzzetta;
• Termometro;
• Cotone;
• Autoclave;
• Piastre Petri di varie dimensioni (9 e 5 cm di diametro);
• Provette;

SOSTANZE E REATTIVI:
• Milk Plate Count Agar
Formula Formula
g/litre G / litro
Calcium chloride (CaCl 2 .2H 2 O) Cloruro di calcio (CaCl 2 .2 H 2 O)
0.02 0,02
Dipotassium hydrogen phosphate Dipotassio idrogeno fosfato
1.8 1,8
Bromocresol purple Violetto di Bromocresolo
0.02 0,02
Glutamic acid (sodium salt) Acido glutammico
12.7 12,7
Tryptone
5.0 5,0
Yeast Extract Estratto di lievito
2.5 2,5
Dextrose Destrosio
1.0 1,0
Antibiotic Free Skim Milk Powder Latte scremato in polvere
1.0 1,0
Agar No. 1 Agar
10.0 10,0
Metodo per la ricostruzione: Weigh 19.5 grams of powder, disperse in 1 litre of deionised water. Pesare 19,5 grammi di polvere, da disperdere in 1 litro di acqua.
pH: 7,0
Sterilizzazione in autoclave: 121°C per 15’.

PROCEDIMENTO:
1. Pesare 1,95 g di terreno disidratato Milk Plate Count Agar;
2. Nel cilindro graduato versare 100 ml di acqua distillata;
NB: l’acqua deve essere distillata di fresco per evitare che l’anidride carbonica presente nell’aria vi si sciolga andando a modificare il pH.
3. Versare i grammi di terreno pesati in un becker aiutandosi con tutta l’acqua contenuta nel cilindro;
4. Agitare il preparato con la bacchetta per evitare la formazione di grumi;
5. Deporre il becker sulla piastra e portarlo all’ebollizione in modo tale che l’agar si solubilizzi completamente e la soluzione diventi limpida;
6. Una volta portato all’ebollizione si toglie dalla piastra riscaldante e si aspetta che la sua temperatura scenda intorno ai 50°C;
7. Controllare il pH mediante cartine indicatrici e verificare che sia uguale a quello scritto sull’etichetta del contenitore del terreno in questione. Qualora non fosse così aggiustarlo con l’aggiunta di HCl o NaOH, a seconda della correzione da apportare;
8. Versare la soluzione in una beuta e “tapparla” con del cotone (che dovrebbe essere avvolto dalla garza in modo da evitare che pilucchi di cotone cadano nella soluzione) e avvolgerlo con della carta d’alluminio. In ogni caso provette o altri contenitori non devono essere mai chiusi ermeticamente per permettere all’aria di fuoriuscire durante il riscaldamento in autoclave dovuto all’aumentare della pressione ed evitare così la loro esplosione;
9. Sterilizzare il terreno in autoclave per uccidere ogni qualsiasi forma di vita sopravvissuta all’ebollizione (ad esempio spore batteriche). Autoclavare per 15 minuti alla temperatura di 121°C;
10. Ricontrollare il pH per verificare che la sterilizzazione non lo abbia modificato;
11. Possibilmente sotto una cappa a flusso laminare versare il terreno nelle piastre (20 ml circa nelle piastre di diametro di 9 cm e 10 ml circa in quelle di 5 cm) e nelle provette. Per aumentare la superficie nelle provette è possibile preparare delle provette a becco di clarino inclinandole. Quest’operazione andrebbe fatta mantenendo il terreno a bagnomaria ad una temperatura superiore ai 45°C, per evitare la solidificazione (42-45°C);
12. Lasciare raffreddare le piastre prima di conservarle in frigo per evitare la formazione di condensa dovuto al raffreddamento.

La durata di conservazione dei terreni varia da due settimane a un mese circa.

ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI RISULTATI:
Il terreno preso in esame è probabilmente un terreno arricchito per la presenza del latte. Dal punto di vista fisico è solido, anche perché la concentrazione di agar è superiore all’1%. È un terreno semi-sintetico poiché la sua composizione chimica non è ben definita, in quanto contiene estratto di lievito e latte.

CONCLUSIONI:
La coltivazione di microrganismi richiede l'utilizzo di appropriati terreni di coltura che riproducono un ambiente ideale in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo di interesse. Questi terreni devono essere sterili e per esserne sicuri nella loro preparazione è possibile fare dei test di sterilità. Questi possono essere:
- chimici: strisce, con indicatore chimico multiparametro che vira di colore, quando esposto a condizioni di tempo, temperatura e vapore sufficienti alla sterilizzazione, sia a 121° C che a 134 ° C, da applicare al contenitore da sterilizzare.
- biologici: indicatori biologici di sterilizzazione a vapore (autoclave) sono spore di bacillo Stereothermophilus vive ma non patogene altamente resistenti al processo di sterilizzazione. Se alla fine dell’autoclavatura queste spore risulteranno morte, il terreno è stato sterilizzato.

APPROFONDIMENTI E ATTIVITÀ CORRELATE:
Ogni terreno utilizza i seguenti ingredienti:
- Peptoni o idrolisati: proteine parzialmente digerite, si tratta quindi di miscele di amminoacidi liberi e polimerizzati, i primi sono ottenuti per digestione enzimatica o i secondi per digestione acida di proteine animali o vegetali e cellule di lievito e rappresentano la fonte principale di azoto.
- Carboidrati: vengono utilizzati come substrati fermentabili per la differenziazione dei microrganismi. I più utilizzati sono il glucosio, il lattosio ed il saccarosio e rappresentano la fonte di carbonio organico.
- Sali: hanno la funzione di fornire gli elementi inorganici necessari alla crescita microbica, fornire un'azione tampone al terreno e mantenere un’adeguata osmolarità nel terreno di coltura.
- Indicatori: gli indicatori si possono suddividere in indicatori di pH, di ossidoriduzione e di idrogeno solforato. Sono indicatori di pH il rosso fenolo, il rosso neutro e il blu di bromotimolo. Gli indicatori di pH evidenziano la formazione di acidi a partire da carboidrati e di basi (ioni di ammonio) a partire dai peptoni, singoli amminoacidi o ammine. Gli indicatori di ossidoriduzione più utilizzati sono il blu di metilene, che ossidato dà una colorazione blu e la resazurina che dà una colorazione rosa. Gli indicatori di idrogeno solforato, sono costituiti da sali di Ferro che reagiscono con l'idrogeno solforato prodotto dai batteri a partire da sodio tiosolfato dando luogo ferro solfuro nero. Questa reazione può originare colonie caratteristiche con parte centrale nera nei terreni di coltura solidi.
- Solidificanti: l'agar è l'ingrediente fondamentale per la preparazione della quasi totalità dei terreni solidi. Si tratta di una sostanza estratta da alghe rosse, ed ha una struttura polisaccaridica. L'agar solubilizzato ha la caratteristica di fondere a 100°C e di solidificare a temperature inferiori ai 45°C.
- Sostanze selettive: permettono l'isolamento di una specie batterica, a tale scopo si utilizzano coloranti, come il cristal violetto ed il verde brillante, impiegato per gli enterobatteri. Vi sono poi sostanze di origine biologica come i sali biliari che inibiscono la crescita dei Gram+. Per l'isolamento mirato di specie batteriche si utilizzano gli antibiotici. Altri agenti selettivi sono i sali organici e inorganici tra cui il cloruro di sodio (in alte concentrazioni inibisce la maggior parte dei microrganismi ad eccezione delle specie alofile), il sodio azide (inibisce i Gram-).
- Sostanze di arricchimento: sangue, latte disidratato, gelatina, vitamine. Queste sostanze sono necessarie per la crescita di batteri più esigenti dal punto di vista nutrizionale.
Dal punto di vista dello stato di aggregazione si distinguono in:
- Solidi o agarizzati: vengono aggiunte sostanze solidificanti in quantità dell’1,5-2%. Normalmente viene usato l’agar come agente solidificante.
- Semisolidi: si aggiunge agar in quantità inferiori all’1%.
- Liquidi o brodi: soluzioni in acqua dei diversi componenti.
In rapporto alla composizione chimica si possono classificare in:
- Naturali: costituiti da sostanze naturali di cui non si conosce la composizione chimica (sangue, latte, malto, patate, ecc…).
- Sintetici: terreni di cui si conosce la composizione chimica.
- Semisintetici o complessi: terreni la cui composizione chimica non è ben definita.
In base alla funzione si distinguono in:
- Terreni universali: favoriscono la crescita della maggior parte dei microrganismi (PCA).
- Terreni di arricchimento o elettivi: sono terreni che consentono la crescita di specie più esigenti. Ai terreni normali vengono aggiunte sostanze di arricchimento come sangue, siero, latte.
- Terreni selettivi o di isolamento: favoriscono la crescita di alcune specie e inibiscono quella di altre. Si ottengono mediante l'aggiunta ai terreni nutritivi di sostanze inibenti quali antibiotici, coloranti e sali. Sono impiegati per isolare le singole specie da materiali plurimicrobici. Esempi sono l’agar salemannite e l’agar MacConckey.
- Terreni differenziali o indicativi: consentono di riconoscere le singole specie batteriche in base alle caratteristiche metaboliche delle colonie.
- Terreni di mantenimento: servono per conservare campioni quando questi non possono essere seminati immediatamente.