La sterilizzazione

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Testo

LA STERILIZZAZIONE

Il mantenimento delle condizioni di sterilità è di importanza fondamentale per la riuscita di un processo biotecnologico in quanto la presenza di organismi in competizione con quelli principali può determinare problemi di varia natura al prodotto. Nel caso di industria alimentare si possono avere alterazioni dell'aroma del sapore della struttura o dell'aspetto. Ancora maggiore deve essere la cura nel caso di produzione di vaccini o prodotti farmaceutici. In altri casi organismi in competizione possono determinare condizioni di pH intollerabili per il processo e per gli organismi principali.
Si può avere un inquinamento del processo in uno qualunque degli stadi che precedono la fermentazione ed in particolare durante le fasi di preparazione dell'inoculo, durante la preparazione del substrato o nell'immissione di aria. Inoltre, lo stesso reattore nonché tutte le tubazioni, raccorderie e valvole devono essere opportunamente sterilizzate. Le condizioni di sterilità vengono intese non in senso assoluto, ma in senso statistico, ovvero non si ricerca tanto la assoluta assenza di organismi estranei, ma è sufficiente che questi siano ridotti a concentrazioni tali da non poter svilupparsi e costituire un problema per il ciclo di lavoro. Il raggiungimento di questo obiettivo può essere relativamente poco oneroso, mentre le condizioni di assoluta sterilità non sono ottenibili se non a costi elevati. Due sono le tecniche di sterilizzazione utilizzate: la rimozione dei microrganismi per filtrazione e la sterilizzazione termica.
1 Sterilizzazione per filtrazione
Questa tecnica viene preferito soprattutto per la sterilizzazione dell'aria, per cui la sterilizzazione termica non può essere economica se non per portate molto ridotte.
L’aria da utilizzare al fermentatore deve essere sterilizzata in quanto può trascinare sempre muffe o batteri. La filtrazione consente cosi di eliminare anche tracce di particolato, umidità, metalli pesanti ed eventuali tracce di olio rilasciate dal compressore. Per le correnti liquide la filtrazione non è generalmente applicata, se non quando il substrato contiene sostanze termolabili.
La filtrazione viene effettuata facendo passare l'aria prima attraverso un prefiltro a porosità 0,45 Lm, che elimina tutte le particelle che potrebbero intasare rapidamente la successiva sterilizzazione. Questa viene effettuata facendo passare l'aria attraverso uno strato filtrante che può essere costituito da membrane filtranti in fluorocarburi con una dimensione media dei pori di 0,2 0,3 0m. Possono essere utilizzati anche filtri in ceramica o fibra di vetro, purché non si abbia rilascio di particelle nel flusso di aria.
La capacità di rimozione dei microrganismi è funzione della velocità, come illustrato in fig., in cui si può notare una capacità minima di rimozione in corrispondenza di una velocità critica. Infatti, sulle particelle agiscono forze di natura diversa, la cui influenza dipende dalla velocità di passaggio dell'aria. A basse velocità prevalgono le forze di tipo diffusionale o elettrostatico, mentre all'aumentare della velocità agiscono forze di tipo inerziale, per cui le particelle solide non seguono le variazioni di direzione della corrente gassosa all’interno del filtro e vengono trattenute a seguito degli urti con questo.
Sul materiale filtrante si accumulano le particelle ed i microrganismi e quindi esso deve essere a sua volta periodicamente sterilizzato con vapore o rimosso interamente.
Dimensioni medie degli inquinanti presenti nell'aria
FILTRI
Efficienza, cioè misura della capacità del filtro a rimuovere le particelle della corrente d’aria che l’attraversa. Si esprime in percentuale e rappresenta un indice della qualità del filtro.
Perdita di carico, rappresenta la caduta di pressione quando una determinata portata attraversa il filtro, viene espressa in Pascal. E’ importante conoscere la sua variazione in funzione del grado di intasamento.
Capacità di contenimento, definisce la quantità di polvere di determinata granulometria che un filtro può trattenere quando un filtro funziona con una determinata portata e perdita di carico.
MECCANISMI DI FILTRAZIONE DELL'ARIA
I meccanismi che entrano in gioco nella filtrazione sono i seguenti:
a) inerzia o collisione:
l'aria che deve essere filtrata subisce un brusco cambiamento di direzione quando passa intorno a ciascuna fibra del filtro. Le particelle proseguono per inerzia il loro cammino e urtano con le fibre. Questo meccanismo è più efficace per le particelle grandi e per alte velocità dell'aria, ma può andar bene per ogni tipo di particelle.
b) setacciatura:
quando l'aria deve passare attraverso le fibre e la larghezza del passaggio è inferiore al diametro delle particelle, la particella stessa si ferma e rimane trattenuta.
C) effetti diffusivi:
le particelle molto piccole vengono bombardate dai movimenti irregolari dell'aria e portate sulle fibre di vetro mediante il movimento della corrente d'aria.
d) effetti elettrostatici:
le particelle caricate elettricamente di segno opposto si attraggono l'una con l'altra; gli effetti elettrostatici sono impiegati nei filtri elettrostatici e in alcuni tipi di filtri fibrosi.
e) effetti di intercettazione:
Il flusso dell'aria in prossimità delle fibre del filtro tende a seguirne il contorno, trascinando nella propria direzione le particelle più fini e leggere. Se la loro traiettoria passa a una distanza dalla fibra inferiore al raggio delle particelle esse vi si fisseranno per forze di attrazione elettrostatica (forze di Van der Waals).
L'efficacia di questo meccanismo aumenta con l'aumentare del diametro delle particelle entro un campo definito, e con il diminuire del diametro delle fibre e delle distanze tra le fibre stesse.
Un filtro di profondità (a), un filtro in acetato di cellulosa tradizionale (b) e un filtro Nucleopore
Microrganismi immobilizzati sulla superficie di un filtro
Filtri sterili, filtri di areazione e sfiato, filtri per vapore, per un'aria compressa priva di batteri e microorganismi a vapore esente da particelle solide
CLASSIFICAZIONE FILTRI
1) Gruppo G (grossolano, per polvere grossa)
2) Gruppo F (per polvere fine)
3) Gruppo H, U (HEPA, ULPA) (ad altissima efficienza)
CARATTERISTICHE DI ALCUNI FILTRI PRESENTI SUL MERCATO
FILTRI A PANNELLO

Sono costituiti da un telaio in cartone o in metallo che contiene un materassino filtrante in fibre vegetali, materiale sintetico, fibra di vetro o truciolato metallico. Il setto è piano o ondulato o pieghettato.
L'arresto delle polveri avviene per effetto congiunto di inerzia e di setaccio. I filetti d'aria attraverso il materassino sono costretti a bruschi cambiamenti di direzione, mentre le particelle di polveri procedono in modo rettilineo fino a incontrare "setacci" di fibre da cui vengono trattenute. Per aumentare la capacità di raccolta e trattenimento delle polveri, i materassini filtranti sono spesso umettati con sostanze viscose che agiscono come adesivi sulle particelle che ne sfiorano o urtano le fibre.
Le velocità frontali dell'aria di progetto per questa classe di filtri sono comprese tra 1,5 e 3,0 m/s. Velocità più elevate rischierebbero di trascinare a valle del filtro le polveri raccolte.
Le perdite di carico di questa classe di filtri, che dipendono dalla qualità e dallo spessore del materassino, sono comprese tra 25 e 50 Pa a filtro pulito e possono raggiungere gli 80-200 Pa a filtro sporco.
Il limite della vita operativa per i filtri trattati con oli adesivi si raggiunge quando gli adesivi stessi risultano completamente essiccati dalle polveri raccolte. In tali condizioni, la capacità di raccolta si riduce drasticamente e subentra il rischio di trascinamento di polveri a valle del filtro stesso.
IMPIEGHI E APPLICAZIONI
I filtri a pannello vengono generalmente utilizzati come elementi di prefiltrazione a monte di filtri di maggiore efficienza, onde prolungare la vita operativa di questi ultimi. Vengono inseriti nelle centrali di trattamento dell'aria, nelle macchine autonome di condizionamento e nei generatori di aria calda.
FILTRI A TASCHE
Filtro a tasche visto negli elementi che lo compongono
Questa classe di filtri offre un campo di prestazioni molto ampio e si distingue per le elevate capacità di raccolta delle polveri. I rendimenti di filtrazione si estendono dal 30% fino al 95% e oltre.
I meccanismi di filtrazione che intervengono sono naturalmente differenti. Gli effetti di inerzia e setaccio prevalgono per rendimenti fino al 50-60%; al di sopra di tali valori acquista maggiore importanza l'intercettazione.
Questi filtri, e in generale tutti quelli ad alta efficienza, non sono rigenerabili e vanno sostituiti al termine della loro vita operativa.
A un telaio di supporto in lamiera d'acciaio zincata sono applicate le tasche in materiale filtrante, per mezzo di fissaggio meccanico e sigillanti.
Le "tasche" vere e proprie sono costituite da materassini in materiali diversi, con densità e diametro delle fibre differenti. Le fibre sintetiche consentono rendimenti medi, mentre l'impiego delle fibre di vetro permette di ottenere prestazioni più elevate.
In questo secondo caso il diametro delle fibre è compreso tra 3 e 10 micron, lo spessore del materassino si aggira tra 5 e 20 mm.
I rendimenti più elevati per questa classe di filtri, tra il 90 e 98% si ottengono con materassini nei quali il diametro delle fibre di vetro è più ridotto, tra 0,5 e 2 micron.
La sistemazione a tasche, permette di ottenere elevati rapporti tra superficie filtrante effettiva e superficie frontale. Per una cella tipica, con superficie frontale nominale di 0,37 m2, la superficie filtrante effettiva può essere compresa tra 2,8 e 9,5 m2.
Questo consente di usufruire di perdite di carico moderate, nonostante la densità e la finezza del materiale filtrante. La velocità dell'aria di attraversamento risulta moderata e contenuta intorno ai 0,5 m/s, pur con velocità frontali intorno ai 3,5 m/s.
La distribuzione dell'aria attraverso le tasche presenta caratteri di uniformità. La polvere non si addensa in punti particolari, bensì tende a distribuirsi su tutta la superficie del filtro
Distribuzione uniforme dell'aria all'interno delle tasche di un filtro
La capacità di raccolta delle polveri, a parità di materiale impiegato e di altre condizioni, aumenta in funzione della lunghezza delle tasche. I filtri comunemente offerti sul mercato presentano lunghezze di tasche comprese tra 360 mm e 915 mm. lì numero di tasche per cella può andare da 6 a 18.
Le perdite di carico a filtro pulito possono andare da 25 a 50 Pa per le prestazioni inferiori, e fino a 80-120 Pa, per i rendimenti più elevati. La perdita di carico finale, a filtro esaurito, può andare dai 200 ai 400 Pa, rispettivamente.
APPLICAZIONI
I filtri a tasche vengono prescelti per applicazioni molto diversificate nel settore civile e nell'industria (elettronica, farmaceutica, alimentare...). La grande capacità di raccolta delle polveri che li caratterizza costituisce un elemento importante ai fini dei periodici interventi di manutenzione che risultano più distanziati nel tempo rispetto all'impiego di filtri d'altro tipo.
FILTRI A PIEGHE PROFONDE
I filtri di questo tipo si collocano in un campo di rendimenti di filtrazione tra il 60 e il 90%.
Si differenziano nettamente dai filtri della classe precedente poiché il materiale filtrante è costituito da carta, contenente fibre di vetro, fittamente ripiegata su se stessa in pieghe profonde. Presentano una netta somiglianza con i filtri assoluti.
La carta, a base di fibre di vetro, che costituisce il pacco filtrante è sistemata all'interno di un telaio di legno e metallo e a esso viene sigillata.
Le pieghe sono mantenute distanziate tra loro per mezzo di distanziatori ondulati (come per i filtri assoluti). I distanziatori possono essere in alluminio, carta kraft e PVC.
La pieghettatura della carta filtrante consente di ottenere una superficie di attraversamento elevata rispetto alla superficie frontale. Rispetto alle precedenti, questa soluzione consente di trattare portate d'aria più elevate a parità di superficie frontale.
Pur con velocità dell'aria nel canale intorno a 1,5 m/s, la velocità di attraversamento si riduce a valori vicini a 0,05 m/s producendo un flusso laminare all'uscita del filtro.
La perdita di carico iniziale, a filtro pulito, è intorno ai 100 Pa; quella finale è pari a tre volte il valore iniziale.
Le normali temperature di lavoro possono raggiungere i 70°C. Esecuzioni speciali consentono di trattare aria surriscaldata fino a 250°C. L'umidità relativa tollerata può raggiungere il 100%. Questi filtri sono generalmente preceduti da opportuni prefiltri che possono essere installati sia all'interno della centrale di trattamento, a valle del ventilatore, sia su pareti filtranti.
FILTRI HEPA
I filtri HEPA/ULPA sono fra i più usati nel sistemi a flusso laminare. In questi filtri il meccanismo di filtrazione è dovuto sia all'urto sia alla diffusione.
L'efficienza di un filtro a urto cresce con l'aumentare delle dimensioni delle particelle da filtrare, mentre l'efficienza di un filtro a diffusione aumenta decrescendo la misura delle particelle da filtrare. L'efficienza finale del filtro è data dalla somma delle curve rappresentative dell'efficienza dei due metodi.
Curva dell'efficienza di un tipico filtro HEPA
Da questa si vede come la minima efficienza di un filtro HEPA si trova approssimativamente intorno a 0,3 µm di diametro.
I filtri HEPA/ULPA con efficienza minima uguale a 99,97% sono costituiti da un foglio pieghettato di carta di microfibre di vetro.
I pacchi filtranti vengono sigillati all'interno di telai di contenimento normalmente in legno, acciaio zincato, alluminio o acciaio inox, per mezzo di materiali adesivi.
La manutenzione dei filtri HEPA/ULPA deve essere effettuata attenendosi scrupolosamente alle indicazioni dei costruttori.
Applicazioni
Tali filtri vanno sempre preceduti da prefiltri di rendimento inferiore, allo scopo di estenderne la vita operativa. L’impiego è ad es. in camere bianche, sale operatorie, laboratori e centri produzione dove si lavora con sostanze radioattive o batteriologiche, centrali nucleari ecc.., ove cioè sia obbligatoria la presenza di filtri assoluti.
FILTRI:
a) misurazione dell'efficienza
b) Metodo: Dop test con particelle di 0,3 micron. Misurazione dell'integrità
c) Metodo: Dop test con particelle da 1 a 3 micron. Perdita di carico: differenza di pressione sui filtri puliti. Massima differenza di pressione ammessa sui filtri.
d) Controllo della velocità del flusso laminare Metodo: misura con anemometro.
e) Controllo della uniformità del flusso laminare Metodo: mediante generatori di fumo.
CONTROLLO DEL NUMERO DI RICICLI E DI RINNOVI DI ARIA/ORA
Metodo: mediante misurazione di portata.
CONTROLLO DELLA TEMPERATURA
Metodo: misura con termometro.
CONTROLLO DELLA UMIDITÀ
Metodo: misura con psicrometro.
CONTROLLO DELLA PRESSIONE DIFFERENZIALE
Metodo: misura con manometro differenziale.
CONTAMINAZIONE PARTICELLARE
Metodo: conta delle particelle con contatore elettronico.
CONTROLLO DEL TEMPO DI DECONTAMINAZIONE
Metodo: mediante generatori di aerosol e contatore di particelle.
CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL'ARIA
Metodo: valutazione del n0 di UFC/m3 mediante campionamento dell'aria con apparecchio idoneo.
CONTAMINAZIONE MICROBICA DELLE SUPERFICI
Valutazione mediante piastre a contatto del numero delle UFC per unità di superficie.
Il controllo viene effettuato su pavimenti, pareti, superfici, attrezzature, macchinari e abiti sterili del personale.
Per pavimenti, superfici attrezzature/macchinari e abiti sterili del personale devono essere stabiliti degli standard interni.
L'area asettica deve essere pulita e disinfettata frequentemente, secondo procedure scritte, utilizzando più di un tipo di disinfettante in modo da evitare lo sviluppo di microrganismi resistenti.
Lavorazioni in ambienti sterili

LOCALI STERILI
Una 'camera bianca (cleanroom)' è una stanza in cui:
• Il ricambio di aria
• La distribuzione dell'aria
• La filtrazione dell'aria
• I materiali di costruzione della stanza
• Le procedure operative nella medesima
Sono regolate per un controllo particellare appropriato alla classe di 'pulizia' come definita da apposite norme.
Importanza della presenza di personale operativo (causa del 25% della contaminazione da particolato)
Fornitura di aria
Velocità all'uscita dei filtri di almeno 0.45 m/sec ± 20%, ricambi 5-600 vol/h, pressione differenziale (+) in cascata.
Distribuzione:
Importanza della presenza sulla volta di luci, sensori ecc. che modificano il flusso, ed ancora arredo e presenza del personale
Nelle tabelle sono riassunti i requisiti ambientali dei locali per produzione di iniettabili, in base alla classe di appartenenza. La classificazione dei suddetti locali è sottoposta a normative in continua evoluzione.
Limiti di classe in particelle per piede cubico aventi grandezza uguale o maggiore delle grandezze indicate (micron)
CLASSE N° particelle misurate aventi grandezza (µm)
0.1 0.2 0.3 0.5 5.0
I 35 7.5 3 1 NA.
10 350 75 30 10 NA.
100 NA. 750 300 100 NA.
1.000 NA. NA. NA. 1.000 7
10.000 NA. NA. NA. 10.000 70
100.000 NA. NA. NA. 100.000 700
Condizioni di contaminazione ambientale per la preparazione di prodotti sterili
CLASSE
Ricambi aria per ora
N° max consentito partic/m3 uguale o superiore
N° max consentito microrganismi viventi per m3
>0.5 µm
>5 µm
A (flusso laminare)
(vertic) 0.3 m/s
(orizz) 0.45 m/s
3500

Inferiori a 1
B
5-20
3500

5
C
5-20
350000
2000
100
D
5-20
3.500.000
20000
500
Note:
Studi hanno dimostrato che in un m3 di aria di città sono presenti non meno di 500.000 microbi, veicolati sulle particelle sospese nell’aria.
La scelta del tipo di filtro e la sequenza in cascata dipenderà quindi dal tipo di aria da trattare
Area asettica
DEFINIZIONE DEI REQUISITI AMBIENTALI
- Flusso dell'aria: laminare.
- Velocità del flusso laminare.
- Uniformità del flusso laminare.
- Ricambi d'aria.
- Classe di contaminazione particellare 100.
- Contaminazione microbica.
- Temperatura.
- Umidità relativa.
- Sovrapressione: la pressione nei locali di classe 100 deve essere superiore rispetto a quella degli altri ambienti circostanti.
Caratteristiche dei locali
─ Le aree lavorative devono essere ben protette da contaminazioni esterne con finestre a tenuta perfetta.
─ Tutti i locali di produzione devono essere disposti secondo un ordine logico ideale dal punto di vista del flusso e della movimentazione dei materiali, del personale nonché delle singole fasi dell'intero processo produttivo.
─ Le zone di transito e di stoccaggio momentaneo dei materiali (zone di passaggio) devono essere separate dalle normali zone di produzione.
─ La superficie delle pareti, dei soffitti e dei pavimenti deve essere liscia e priva di fessure. Il tipo di superficie delle pareti deve consentire la massima efficienza delle operazioni di pulizia e disinfezione. Superfici danneggiate o rotte devono essere immediatamente riparate.
─ Gli scarichi dovrebbero essere evitati quando possibile, in quanto scarichi, sifoni e lavelli ospitano una grande varietà di microrganismi che possono diffondersi nei locali di produzione.
─ Le tubazioni devono essere installate, nei limiti del possibile, all'esterno degli ambienti di lavorazione.
─ La rete di distribuzione dell'acqua di processo e delle soluzioni deve essere preferibilmente in acciaio inox, facilmente sanificabile con disinfettanti o vapore, e con una pendenza adeguata, in modo da evitare il ristagno. Tutte le tubazioni devono inoltre essere chiaramente identificate per il tipo di fluido contenuto e la direzione del flusso.
─ L'impianto di illuminazione deve essere progettato in modo da non rappresentare un accumulo di polvere e sporcizia.
─ Le attrezzature fisse, così come i lavandini, e i macchinari devono essere sistemati in modo da consentire una pulizia accurata.
─ Le condizioni termoigrometriche devono essere confortevoli per il personale e adeguate per i prodotti che vi stazionano (p. es. prodotti igroscopici).
─ La ventilazione deve essere conforme alle esigenze stabilite per le specifiche classi di appartenenza dei locali. All'interno dei locali di classe 100, 10.000 e 100.000 le fasi lavorative, per le quali il rischio di contaminazione del prodotto è elevato, dovrebbero essere eseguite sotto cappe a flusso laminare.
─ Tutti i locali devono essere in sovrapressione rispetto ai locali circostanti e ai locali di classe inferiore.
─ Ogni area lavorativa deve avere un elevato grado di pulizia. Allo scopo deve essere stabilita una procedura di pulizia e sanitizzazione specifica per ogni locale di produzione.
─ Livelli di contaminazione particellare e microbica devono essere stabiliti in funzione dei requisiti del prodotto lavorato.
─ La polvere generata dal processo lavorativo deve essere eliminata mediante impianto idoneo per l'estrazione dell'aria. Aspiratori devono essere installati in corrispondenza dei punti dove c'è maggior possibilità che si sviluppino polveri.
─ L'aria estratta dai locali deve essere passata attraverso un dispositivo per la rimozione del pulviscolo e quindi scaricata all'esterno dell'edificio.
─ Materiali e linee produttive devono essere posizionati in modo da evitare rischi di contaminazione crociata di medicamenti. A questo scopo le operazioni devono essere svolte all'interno di aree specificamente delimitate e di dimensioni adeguate.
Importanza delle finiture !! Superfici, guarnizioni, alimentazione energetica, scarichi
Es scarico a pavimento
Personale (addetto alle lavorazioni in ambiente sterile)
Qualificazione del personale.
Sensibilizzazione e responsabilizzazione
• caratteristiche chimico-fisiche del prodotto
• tipo di processo e fasi critiche
• tipo di trattamento sterilizzante e fasi critiche
• comportamento in ambiente sterile e concetto di sterilità
Addestramento (con verifica dell’acquisizione)
Es. come lavarsi le mani:
Abbigliamento
Proteggere l'operatore dal prodotto ed il prodotto dall'operatore e la contaminazione di un prodotto da parte di un altro prodotto.
precisi requisiti di foggia e di tipo di tessuto per evitare al massimo l'emissione particellare, dal punto di vista della vestibilità e della sicurezza.
requisiti:
• facilità di traspirazione
• tessuto anallergico
• tessuto non elettrostatico
• indumento sfilabile facilmente
• indumento che non consenta l'accumulo di prodotto sulla superficie
• efficace barriera-filtro alla contaminazione di origine umana
• decontaminabile, sterilizzabile

Devono sempre essere esaminati i punti critici, quali le cuciture dell'indumento, in quanto è la costruzione dell'indumento che ne determina l'effetto globale come filtro.
Caratteristiche del tessuto:100%poliestere a filamento continuo a porosità controllata (E 1 90% diam. 0.19-0.3 µm)
Note:
Nell’essere umano si ha un ricambio totale dello strato corneo in 4 giorni, con un emissione di circa 20 milioni di particelle/giorno. Inoltre occorre ricordare la presenza di flora batterica in ghiandole sebacee, bulbi piliferi e superficie cornea. In condizione di riposo si stima una emissione di 100.000 particelle/minuto (diametro >0.3 µm) di cui il 10% circa contiene microrganismi.
2 Sterilizzazione termica
La sterilizzazione termica viene generalmente adoperata per la sterilizzazione del brodo di fermentazione e per la sterilizzazione delle apparecchiature prima del ciclo di lavorazione. In questo caso viene iniettato vapore a 120°C nel reattore e in tutte le attrezzature impiegate. Inoltre la sterilizzazione termica viene adottata per i gas in uscita dai fermentatori, nei casi in cui questi contengano microrganismi pericolosi, ovvero quando sono impiegate le tecniche del DNA ricombinante. Tutti i microrganismi possiedono un range di temperatura ottimale per cui, a temperature più basse, il loro metabolismo viene bloccato, mentre, ad alte temperature, vengono uccisi. Su questo si basa la sterilizzazione termica, che consiste nell'esporre il mezzo da sterilizzare a temperature elevate per un tempo sufficiente a ridurre la carica batterica entro valori accettabili.
La velocità di riduzione dipende sia dalla temperatura che dal tempo di esposizione, secondo una cinetica analoga alle reazioni del primo ordine:
dove N è il numero di microrganismi all'istante generico t e KT e una costante specifica del tipo di microrganismo che dipende dalla temperatura.
Dall'integrazione della si ottiene:
La costante KT assume valori sempre più elevati all'aumentare della temperatura, per cui per ottenere la stessa riduzione a temperature più elevate sono sufficienti tempi inferiori di esposizione.
Esempio:
Per la sterilizzazione del brodo di fermentazione si possono usare due tecniche, il riscaldamento tramite iniezione diretta di vapore o il riscaldamento con scambiatori di calore. Nel primo caso il liquido viene aspirato tramite un eiettore alimentato dalla stesso vapore di riscaldamento, consentendo così una perfetta miscelazione delle due correnti. Quindi la miscela liquido/vapore passa attraverso un serpentino che ha la funzione di mantenere la miscela alla temperatura di sterilizzazione per il tempo sufficiente a ridurre la carica microbica. Quindi tramite una valvole di espansione, si ha una diminuzione di pressione e contemporaneamente una parziale vaporizzazione che raffredda il brodo prima della sua utilizzazione nel fermentatore.
Quando il liquido non contiene solidi in sospensione in quantità eccessiva è possibile portare alla temperatura di sterilizzazione tramite scambiatori di calore. Nell’impianto illustrato il liquido entra in un primo scambiatore, dove viene preriscaldato a spese del liquido uscente dal secondo scambiatore. Quindi entra al secondo scambiatore dove viene portato alla temperatura di sterilizzazione grazie ad una corrente di vapore.
Dopo un tempo di permanenza alla temperatura di sterilizzazione viene inviato al preriscaldatore e, infine, viene refrigerato sino alla temperatura di immissione nel fermentatore. Con questa tecnica è possibile recuperare parte del calore e ridurre la portata di vapore necessaria. Allo scopo possono essere utilizzati anche scambiatori a piastre

I più diffusi metodi di sterilizzazione
Sterilizzazione mediante vapore saturo in pressione
Il trattamento termico di sterilizzazione in autoclave con vapore d’acqua saturo in pressione ha l’effetto di eliminare i microrganismi per le temperature elevate sviluppate in ambiente umido e, in parte, per i processi di ossidazione delle membrane cellulari.
Le attrezzature utilizzate allo scopo sono rappresentate dalle autoclavi, dotate di una o più porte di accesso per il carico e lo scarico del materiale da sterilizzare. I contenitori di liquidi e solidi da sterilizzare devono permettere al vapore di penetrare in profondità e, a tale scopo, il ciclo di sterilizzazione vero e proprio viene fatto precedere da una serie di fasi successive di estrazione dell’aria e di immissione del vapore che, oltre ad effettuare il preriscaldamento, contribuiscono ad espellere dagli interstizi tutta l’aria residua.
Al termine della fase di estrazione dell’aria inizia la fase di riscaldamento con l’immisione di vapore saturo fino al raggiungimento della temperatura di lavoro fissata generalmente tra i 120 e i 135°C. A partire da questo momento inizia il conteggio del tempo di sterilizzazione. Per ogni temperatura tra i 120 e i 135 °C, è stato fissato un tempo di sterilizzazione che garantisce la somministrazione della dose letale di calore a tutto il carico, indipendentemente dalla sua disomogeneità (ad esempio, per 135°C almeno 12-15 minuti).
Terminata la fase di sterilizzazione viene aperta automaticamente la valvola di comunicazione con l’ambiente esterno e, una volta raggiunto il bilanciamento barico, inizia una fase di messa sotto vuoto che ha l’effetto di asciugare il carico e di abbassare la temperatura per effetto dell’evaporazione delle eventuali condense esistenti.
La garanzia dell’efficacia del trattamento è elevata, a patto che il controllo delle condizioni fisiche sia eseguito correttamente e che periodicamente sia effettuata la verifica biologica.
Sterilizzazione mediante vapore saturo in pressione e microonde
Lo sterilizzatore è classificato nella gamma degli sterilizzatori a vapore in pressione: il procedimento avviene in una camera chiusa nella quale viene immesso vapore saturo a una pressione di 2 bar e irradiato con onde elettromagnetiche di frequenza superiore ai 2,4 Ghz.
All’interno del forno di sterilizzazione si sviluppa una temperatura maggiore di 132°C dovuta sia alla pressione del vapore saturo, sia all’effetto di riscaldamento delle microonde. L’azione del campo elettromagnetico induce un effetto che sviluppa energia termica che garantisce il raggiungimento della sterilizzazione in ogni punto interno del forno.
La temperatura e la pressione generate nel forno vengono mantenute automaticamente dal computer di bordo che regola l’azione dei produttori di microonde (magnetron) e dell’insufflazione di vapore.
Sterilizzazione mediante radiazioni ionizzanti (raggi S)
Le radiazioni ionizzanti (raggi L) utilizzate con tecnologia di sorgenti radioattive Co 60 e Cs 137 ed esposizioni di 2,5 MR/h hanno effetti di distruzione o inibizione dei microrganismi, con effetto non istantaneo, per alterazioni proteiche. Si può ottenere un’eliminazione totale dei microrganismi senza aumento di temperatura e un livello finale di radioattività indotta nel materiale trattato trascurabile mentre per contro possono verificarsi reazioni collaterali con odori molesti, prodotti indesiderati della scissione, quali ad esempio tossine batteriche.
Sterilizzazione mediante elettroni veloci (raggi S)
Gli elettroni veloci (raggi G) hanno effetti di degradazione molecolare, con modifiche di tipo chimico, fisico e biologico. Con questo sistema non si sviluppano sottoprodotti indesiderati ma, per contro, l’impianto ha dimensioni notevoli ed elevati consumi energetici.

STERILIZZAZIONE MEDIANTE CALORE
Azione del calore sui microrganismi → denaturazione proteine
In fase vegetativa kill 80°C per 10 min idem virus in materiale biologico
Spore 110-120°C per tempo variabile con saturazione vapore nell’ambiente
Calore secco → tempi maggiori 1h a 180°C, 3 h a 140°C
STERILIZZAZIONE A SECCO:
• incenerimento
• con aria surriscaldata: 30 min a 180°C – 60 min a 170°C – 120 min a 160°C - 180 min a 140°C con fasi di sovrapressione iniziale e nel raffreddamento.
INDICATORE: spore B. subtilis var niger (ATCC 9392) seccate su vetrino. Il n° spore vitali < 105 per unità indicatore. D a 160°C circa 5-10 min
STERILIZZAZIONE IN AMBIENTE UMIDO
Tempi di esposizione alle varie temperature
Temperatura
Pressione relativa
Tempo di esposizione
°C
atm
mbar
kPa
121
1,00
1,01
101
15'
126
1,36
1,38
138
10'
132
1,83
1,85
185
6'
134
2,00
2,03
203
4'
150
3,00
3,80
384
3'
Flusso aria e vapore in autoclave.
Eliminare completamente l'aria
AUTOCLAVE DI STERILIZZAZIONE A PIOGGIA DI ACQUA SURRISCALDATA
Per controbilanciare la sovrapressione all'interno dei contenitori durante il ciclo di sterilizzazione, evitando rotture, deformazioni…
STERILIZZAZIONE MEDIANTE AGENTI CHIMICI
AUTOCLAVE A GAS OSSIDO DI ETILENE

C2H4O
Gas, solubile in acqua e solventi, infiammabile in aria (dal 3 all'80%) → 10% in CO2
Spettro d'azione- tutti i microorganismi
Meccanismo - alchilazione
Fattori che influenzano l'azione:
concentrazione: es 150 mg/l a 1 bar
500 mg/l 3 bar
700 mg/l a 4.2 bar
temperatura (40-60°C)
umidità (40-70 RH%)
durata esposizione (3-4 ore)
Utilizzo: presidi medico chirurgici,
NO PVC, polveri termolabili.
Indicatore B. Subtilis
!! Assorbimento da parte del materiale →lavaggio con aria sterile ripetuto
ALTRI AGENTI
ALDEIDE FORMICA
Gas o liquido (paraformaldeide), solubile in acqua (40% in acqua = formalina)
Spettro d'azione- tutti i microorganismi
Meccanismo - alchilazione, riducente
Fattori che influenzano l'azione:
concentrazione: 5 g/m3
temperatura- durata esposizione 72h a 22°C, 14h a 35°C, 5h a 60°C, 1h a 125°C
umidità (70-95 RH%)
Utilizzo: presidi medico chirurgici, condizionatori, ambienti…. NO per Polietilene e vernici sintetiche - materiale poroso ostacolo alla penetrazione
Applicazione: in ambiente aperto, in camere di sterilizzazione (con vapore a pressione negativa)
Indicatore: B.subtilis niger, B.stearotermophilus
Abbattimento con vapori di ammoniaca
Svantaggi: tempi lunghi, abbattimento
ALDEIDE GLUTARICA
Liquido solubile in acqua, alcooli..
Impiego: 2% A:G: + 0.3% NaHCO3 in acqua (pH 7.9)
Meccanismo - reazione con componenti parete batterica, inibizione DNA, RNA (alterazione struttura), inibizione enzimi
Applicazione: immersione nella soluzione per 10 min-3h
Utilizzo: apparecchiature chirurgiche
Beta-propiolattone ([CH2]2OCO)
Liquido non-infiammabile, bassa tensione di vapore, agente alchilante simile ETO.
Condizioni ottimali: conc. 2-4 mg/l, RH 70%, T 24°C, esposizione 2h
Scarsa penetrazione, ottimale per superfici.
STERILIZZAZIONE CON RADIAZIONI
Radiazioni beta (elettroni)
Da 90Sr, penetrazione di qualche mm, acceleratori di particelle (3-15 MeV)
Raggi gamma
Da 60Co, 137Cs, penetrazione 10 cm. Affidabili, nessun danno meccanico. Problema sorgente
Rad: unità arbitraria assorbimento di 100 erg/gr prodotto irradiato
Sterilizzazione con 2.5 Mrad = 6 cal/gr vs 100 cal/gr per steril. con vapore
Tempo sterilizzazione: anche varie ore → tutto il carico 2.5 Mrad
Le rad. ionizzanti provocano mutazioni, formazioni di radicali reattivi. Spore e virus sono 4-5 volte più resistenti di batteri
Vantaggi: sterilizzazione polveri e materiale in contenitore finale
Svantaggi: costi, locali idonei, potenziale danno anche a p.a.
Materiale sterilizzabile con rad:
presidi medico-chirurgici, sigillati in contenitori di PP ( mai PVC, cellofane, cotone) e imballati in scatoloni
prodotti biologici (protesi, cartilagini), prodotti liofilizzati, talco, steroidi, antibiotici in polvere
Le barre di 60Co possono contenere anche 1 MCi con emissione di 30kW/sec. Sostituzione di barre ogni anno. Le barre arrivano incontenitori di Pb, immessi in una vasca di acqua deionizzata (5 mt di profondità) e poste su un telaio.
Indicatori biologici: spore B. pumilus, B. cereus, B. sphaericus
Radiazioni UV (240-280 nm)
Mediante lampade a Hg a bassa pressione → lampade germicide per ambienti.
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Esempio



  



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